實時熒光定量pcr儀，由熒光定量系統和計算機組成，用來監測循環過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數據被繪制成熒光強度相對于循環數的圖表。原始數據收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設定域值水平，這就是分析熒光數據的水平。

5700將PCR熱循環，熒光檢測和各種應用分析軟件結合在一起，可以動態觀察PCR每一循環各反應管中PCR擴增產物逐漸增加的情況。PCR實驗結束后可以馬上得到定量結果，無需凝膠電泳分析，無需純化PCR產物，無需進行任何實驗操作。5700型實時熒光定量PCR系統采用96孔反應板或單個及8聯管，反應體積25-100微升，實驗可以在不到2小時內結束。與其他人工基因定量分析方法如Northern blotting or RNase-protection assays相比，5700型實時熒光定量PCR系統具有時間省，靈敏度高，準確性好和線性范圍寬等優點。

1.可進行準確的定量檢測，實時性和準確性好。

2.定量范圍寬。

3.靈敏度高。

4.特異性和可靠性更強，克服了假陽性。

5.操作簡單快速，無污染，無須后處理和電泳檢測。

6.安全，技術易于學習，易于進行電腦化數據管理.

7.目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。

所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量主要用于絕對定量、mRNA基因表達差異，單核苷酸多態性（SNP）基因分型檢測，Non-coding RNA和microRNA分析，基因拷貝數（CNV）分析，DNA稀有突變分析，可檢測占背景野生型細胞0.5%的微量突變細胞或DNA，基于熒光定量PCR儀的蛋白表達和蛋白相互作用分析等。

1、六個檢測通道，可實現5重PCR，可同時檢測5個靶基因，專用FRET檢測通道。

2、有動態溫度梯度PCR功能，可以同時運行8個不同的溫度，每個溫度孵育時間相同。

3、完全試劑開放，各種科研和臨床試劑適用。

4、適用于多種熒光方法，如Taqman，Molecular Beacon，FRET探針，SYBR Green I等。

5、耗材開放，可使用0.2ml單管、八聯管、96孔板等。

6、可獨立運行，真正離線操作，無需連接電腦即可實時監控PCR熒光擴增曲線。

1、模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃（左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。

2、模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。

3、引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

1.在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA斷裂。

2.為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。

3.內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4.PCR不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定。

5.防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA樣品，在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

6.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

7.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

8.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。